Multi PCR -sæt

Ultrahøj aktivitet og høj specificitet Taq DNA-polymerase.

Multi PCR Kit er et produkt specielt udviklet til multiplex PCR. Multi HotStart DNA -polymerasen i sættet er kemisk modificeret og er den bedste HotStart -polymerase, der er fundet hidtil. Opfindelsen gør det muligt for flere par PCR -primere at udføre god amplifikation i det samme reaktionssystem, og multiplex PCR -reaktioner kan udføres følsomt.

Kat. Ingen Pakningsstørrelse
4992787 5 U × 50 rxn
4992788 5 U × 50 rxn

Produktdetaljer

Eksperimentelle eksempler

Ofte stillede spørgsmål

Produktmærker

Funktioner

■ Høj specificitet: Kemisk modificeret hot-start-enzym med aktiveringstid på op til 15 minutter for at sikre amplificering med høj specificitet.
■ Høj følsomhed: Lav kopiforstærkning og højeffektiv forstærkning af multiplex PCR.
■ Enkel betjening: Enzymet er inaktivt ved lav temperatur og stuetemperatur, og reagenset kan fremstilles ved stuetemperatur.

Aktivitetsdefinition

1 enhed (U) HotStart Taq DNA Polymerase-aktivitet er defineret som den mængde enzym, der kræves for at inkorporere 10 nmol deoxynucleotider i syre-uopløselige stoffer ved 74 ℃ inden for 30 minutter under anvendelse af aktiveret laks-sæd-DNA som skabelon/primer.

Vigtigste tekniske parametre

Det har 5′-3 ′ exonuclease-aktivitet og ingen 3′-5 ′ exonuclease-aktivitet med den stærkeste specificitet. 3' -enden af ​​PCR -produktet er A, som kan bruges direkte til TA -kloning.

Specifikation

Type: Kemisk modificeret HotStart DNA-polymerase
Ansøgninger: Multiplex PCR-eksperiment, detektionseksperiment med høj specificitet, amplifikation af lavkopieret gen, PCR-amplifikation af skabeloner med komplekse strukturer (såsom genomisk DNA, cDNA osv.).

Alle produkterne kan tilpasses til ODM/OEM. For detaljer,klik venligst på Tilpasset service (ODM/OEM)


  • Tidligere:
  • Næste:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×
    Experimental Example Experimental Example Brug menneskeligt genom som skabelon til at forstærke 7 forskellige fragmenter (100 bp-1000 bp)
    Bemærk:
    ① Bestemmelse af forlængelsestid for amplifikation af forskellige længder i multiplex PCR: For fragmenter mindre end 500 bp, forlæng i 60 sek. For fragmenter på 500-1500 bp, forlæng i 90 sek. For fragmenter over 2000 bp, forlæng i 120 sek.
    ② Hot-start kræver opvarmning ved 95 ° C i 15 minutter for at sikre tilstrækkelig frigivelse af enzymaktivitet.
    Q: Ingen forstærkningsbånd

    A-1 skabelon

    ■ Skabelonen indeholder protein -urenheder eller Taq -hæmmere osv. —— Rens DNA -skabelon, fjern protein -urenheder eller ekstraher skabelon -DNA med oprensningssæt.

    ■ Denatureringen af ​​skabelonen er ikke fuldført —— Forøget denatureringstemperatur passende og forlæng denatureringstiden.

    ■ Nedbrydning af skabeloner —— Forbered skabelonen igen.

    A-2 Primer

    ■ Dårlig kvalitet af primere —— Re-syntetisere primeren.

    ■ Nedbrydning af primer —— Alikvoter primerne med høj koncentration i lille volumen til konservering. Undgå flere frysninger og optøninger eller langtids 4 ° C kryokonserveret.

    ■ Ukorrekt udformning af primere (f.eks. Primerlængde ikke tilstrækkelig, dimer dannet mellem primere osv.) -Rediger primere (undgå dannelse af primer -dimer og sekundær struktur)

    A-3 mg2+koncentration

    ■ Mg2+ koncentrationen er for lav —— Korrekt stigning Mg2+ koncentration: Optimer Mg2+ koncentration ved en række reaktioner fra 1 mM til 3 mM med et interval på 0,5 mM for at bestemme den optimale Mg2+ koncentration for hver skabelon og primer.

    A-4 Udglødningstemperatur

    ■ Den høje udglødningstemperatur påvirker bindingen af ​​primer og skabelon. —— Reducer udglødningstemperaturen, og optimer tilstanden med en gradient på 2 ° C.

    A-5 Forlængelsestid

    ■ Kort forlængelsestid —— Forlæng forlængelsestiden.

    Q: Falsk positiv

    Fænomener: Negative prøver viser også målsekvensbåndene.

    A-1 Forurening af PCR

    ■ Krydsforurening af målsekvens eller amplifikationsprodukter —— Forsøg ikke at pipette prøven, der indeholder målsekvensen, i den negative prøve eller spilde dem ud af centrifugerøret. Reagenserne eller udstyret skal autoklaveres for at fjerne eksisterende nukleinsyrer, og forekomsten af ​​kontaminering bør bestemmes gennem negative kontrolforsøg.

    ■ Kontaminering af reagenser —— Alikvoter reagenserne, og opbevar dem ved lav temperatur.

    A-2 Primer

    ■ Mg2+ koncentrationen er for lav —— Korrekt stigning Mg2+ koncentration: Optimer Mg2+ koncentration ved en række reaktioner fra 1 mM til 3 mM med et interval på 0,5 mM for at bestemme den optimale Mg2+ koncentration for hver skabelon og primer.

    ■ Forkert primerdesign, og målsekvensen har homologi med ikke-målsekvensen. —— Re-design primere.

    Sp: Ikke-specifik forstærkning

    Fænomener: PCR-amplifikationsbåndene er uforenelige med den forventede størrelse, enten store eller små, eller nogle gange forekommer både specifikke amplifikationsbånd og uspecifikke amplifikationsbånd.

    A-1 Primer

    ■ Dårlig primerspecificitet

    —— Re-design primer.

    ■ Primer -koncentrationen er for høj —— Forøg korrekt denatureringstemperaturen og forlæng denatureringstiden.

    A-2 mg2+ koncentration

    ■ Mg2+ koncentrationen er for høj —— Reducer Mg2+ -koncentrationen korrekt: Optimer Mg2+ koncentration ved en række reaktioner fra 1 mM til 3 mM med et interval på 0,5 mM for at bestemme den optimale Mg2+ koncentration for hver skabelon og primer.

    A-3 termostabil polymerase

    ■ Overdreven enzymmængde —— Reducer enzymmængden passende med intervaller på 0,5 U.

    A-4 Udglødningstemperatur

    ■ Glødningstemperaturen er for lav —— Hæv glødetemperaturen passende, eller anvend to-trins glødemetoden

    A-5 PCR-cyklusser

    ■ For mange PCR -cykler —— Reducer antallet af PCR -cyklusser.

    Q: Patchy eller smear bands

    A-1 Primer——Dårlig specificitet —— Gendesign primeren, ændr primerens position og længde for at forbedre dens specificitet; eller udføre indlejret PCR.

    A-2 Skabelon-DNA

    ——Skabelonen er ikke ren —— Rens skabelonen, eller udtræk DNA med rensningssæt.

    A-3 mg2+ koncentration

    ——Mg2+ koncentrationen er for høj —— Reducer Mg korrekt2+ koncentration: Optimer Mg2+ koncentration ved en række reaktioner fra 1 mM til 3 mM med et interval på 0,5 mM for at bestemme den optimale Mg2+ koncentration for hver skabelon og primer.

    A-4 dNTP

    —— Koncentrationen af ​​dNTP’er er for høj —— Reducer koncentrationen af ​​dNTP på passende vis

    A-5 Udglødningstemperatur

    ——For lav udglødningstemperatur —— Forøg passende udglødningstemperatur

    A-6 cykler

    ——For mange cykler ——Optimér cyklustallet

    Sp .: Hvor meget skabelon -DNA skal tilføjes i et 50 pi PCR -reaktionssystem?
    ytry
    Sp: Hvordan forstærkes lange fragmenter?

    Det første trin er at vælge den passende polymerase. Regelmæssig Taq-polymerase kan ikke korrekturlæses på grund af mangel på 3'-5 'exonukleaseaktivitet, og mismatch vil i høj grad reducere forlængelseseffektiviteten af ​​fragmenter. Derfor kan almindelig Taq -polymerase ikke effektivt amplificere målfragmenter større end 5 kb. Taq -polymerase med særlig modifikation eller anden højfidelitetspolymerase bør vælges for at forbedre forlængelseseffektivitet og opfylde behovene ved langfragmentforstærkning. Derudover kræver amplifikation af lange fragmenter også tilsvarende justering af primerdesign, denatureringstid, forlængelsestid, buffer-pH osv. Normalt kan primere med 18-24 bp føre til bedre udbytte. For at forhindre skabelonskade bør denatureringstiden ved 94 ° C reduceres til 30 sekunder eller mindre pr. Cyklus, og tiden til at stige temperaturen til 94 ° C før forstærkning bør være mindre end 1 min. Desuden kan indstilling af forlængelsestemperaturen til ca. 68 ° C og design af forlængelsestiden i henhold til hastigheden på 1 kb/min sikre effektiv forstærkning af lange fragmenter.

    Sp: Hvordan forbedres PCR's amplifikationsfidelitet?

    Fejlhastigheden ved PCR -amplifikation kan reduceres ved anvendelse af forskellige DNA -polymeraser med høj kvalitet. Blandt alle de Taq DNA -polymeraser, der er fundet indtil nu, har Pfu -enzym den laveste fejlrate og den højeste troværdighed (se vedhæftede tabel). Ud over enzymudvælgelse kan forskere yderligere reducere PCR -mutationshastighed ved at optimere reaktionsbetingelser, herunder optimering af buffersammensætning, koncentration af termostabil polymerase og optimering af PCR -cyklustal.

    Skriv din besked her og send den til os